Risposta sistemica allo stress dopo somministrazione di "Pelargonium Sidoides"
Roberto Accinni Enzo Soresi
C.N.R.
Ospedale di Niguarda
Il genere umano è costantemente esposto a numerosi fattori fisici, fisiologici, chimici e sociali che mettono in pericolo il proprio equilibrio fisiologico. Ogni condizione che minaccia lo stato di omeostasi è considerata uno stress e le cause che conducono ad esso sono chiamate fattori di stress. Questi esercitano il loro effetto attraverso vie umorali e neurali che insieme conducono a diverse reazioni d’organo. La "risposta allo stress" che comprende un’ampia gamma di effetti endocrinologici, immunologici ed ematologici, è il nome dato alle alterazioni metaboliche e ormonali che seguono lesioni o traumi e costituisce una parte della reazione sistemica e cellulare all’insulto (1).
Una risposta sistemica allo stress fa parte della reattività generale di un organismo ed è imprevedibile a livello individuale e tutti i suoi componenti hanno lo scopo di proteggere l’organismo e di evitare il pericolo. Indicazioni oggettive di stress nella fase acuta comprendono tra molte altre, alti livelli serici di ormoni adrenocorticoidi, adrenalina e cortisolo, deplezione di eosinofili serici, aumento di insulina e somatotropina nel sangue, aumento della pressione arteriosa e variazioni nell’attività elettrica del cervello; mentre i segnali soggettivi includono eccitabilità, palpitazioni, comportamento impulsivo, febbre, ecc.
Un metodo per la valutazione dello stress nelle numerose malattie in cui è coinvolto, implica la misurazione di fattori di stress che sono importanti nelle reazioni della fase acuta, come cortisolo, catecolamine, proteine della fase acuta ed antiossidanti nelle condizioni di stress ossidativo (2). Il livello serico di questi marcatori varia nelle differenti situazioni patologiche: infezione, infarto, interventi chirurgici, ustioni e cancro.
Gli antiossidanti sono composti che prevengono le reazioni ossidative, pertanto la loro presenza è di grande beneficio nelle infezioni ed inoltre si pensa siano alla base della risposta immune cellulare.
Il disequilibrio tra la produzione di radicali liberi e la loro neutralizzazione porta ad uno stato di stress ossidativo (3) caratterizzato da una eccessiva produzione di radicali liberi che possono nuocere alla struttura e funzione della cellula, modificando DNA, proteine, carboidrati e grassi. Metodi in HPLC, GC-MS, colorimetrici ed enzimatici sono in grado di determinare quantitativamente il grado di danno subito da queste molecole, mediante l’analisi di marcatori specifici come 8-idrossi-2-deossiguanosina per il DNA, AGE (prodotti terminali di glicazione) per i carboidrati, gruppi carbonilici per le proteine, lipoperossidi, mono e dialdeidi, isoprostani per acidi grassi.
Queste reazioni ossidative a catena possono causare deplezione di ossigeno, così come ogni molecola di O2 è sorgente di nuovi radicali liberi e ciascuna reazione termina con un danno cellulare.
Pertanto un aumento della produzione di pro-ossidanti [radicali liberi (RL), specie reattive dell’ossigeno (ROS), dell’azoto (RNS), dello zolfo e del cloro] rispetto al sistema riducente (antiossidante) dell’organismo, altera la bilancia ossidativa, un sistema dinamico multicompartimentale dove la modificazione di un elemento si riflette su tutti gli altri, alterandone sia la concentrazione sia l’attività biologica. Uno di questi compartimenti, che costituisce un importante marcatore di omeostasi cellulare è lo stato redox dei tioli. Questi aminoacidi solforati, sono tra loro in equilibrio dinamico e la variazione di uno di essi produce cambiamenti nell’assetto degli altri e su numerosi meccanismi biologici (4,5).
Il sistema riducente endogeno necessita di un adeguato metabolismo energetico per permettere il trasferimento degli elettroni, indispensabili non solo per creare le condizioni necessarie per l’equilibrio della bilancia ossidativa, ma anche per mantenere in forma ridotta molecole chiave per la funzione endoteliale come la tetraidrobiopterina coenzima della eNOS (ossidonitrico-sintasi) enzima responsabile della corretta produzione di NO, oppure per la riduzione dell’acido folico a tetraidrofolico precursore del 5-metil-tetraidrofolato, a sua volta implicato in centinaia di reazioni di metilazione nel nostro organismo.
Se nella fase acuta della malattia, per rilevare l’entità e talvolta la natura dello stress ossidativo, sia che esso risulti avere un ruolo causale e/o consequenziale per la patologia stessa, esistono i marcatori biochimici sopra descritti, in condizioni non patologiche tali strumenti diagnostici vengono a mancare; ad esempio quando lo stress ossidativo è considerato "più semplicemente" un fattore di rischio, la sua azione potrebbe sembrare meno pericolosa in quanto i markers di ossidazione sopra riportati non vengono prodotti e la risposta sistemica allo stress sembra in gran parte o del tutto silente. Nell’organismo sano sono diversi i processi che generano ROS. I più importanti sono quelli relativi al trasporto di elettroni a livello dei mitocondri (catena respiratoria), alle difese immunitarie, alla formazione di eicosanoidi ed al metabolismo di alcuni xenobiotici come i farmaci. Le vie mitocondriali per la produzione di energia (ATP) culminano con la catena di trasporto degli elettroni e con il trasferimento accoppiato di quattro elettroni (e quattro protoni) all’ossigeno molecolare per formare acqua. Questa reazione finale catalizzata dalla citocromo ossidasi è "sicura", ed il coordinato, sequenziale trasferimento di quattro singoli elettroni è raramente associato al danno da radicali liberi; tuttavia sebbene l’intera sequenza abbia un alto grado di efficienza, alcune ROS, corrispondenti all’1-4% del consumo totale di ossigeno, sfuggono alla catena respiratoria .
L’omeostasi cellulare, in condizioni fisiologiche, è mantenuta da un efficiente metabolismo riducente (antiossidante) che usualmente è associato al metabolismo energetico.
L’invecchiamento e numerosi fattori di rischio cardiovascolari hanno come denominatore comune lo stress ossidativo, che nella fase iniziale, per la mancanza di tecniche analitiche sufficientemente sensibili e/o disponibili nella routine clinica, non può essere facilmente rilevato e ancor più quantificato. Tuttavia è possibile analizzare con metodologie sensibili e specifiche (6-10), anche piccole alterazioni dell’omeostasi, del substrato energetico e del metabolismo redox, rivelando così l’eventuale presenza di stress ossidativo seppure di lieve entità nella popolazione sana o con fattori di rischio cardiovascolare come dislipidemia, diabete, fumo, ipertensione ecc.
Pertanto variazioni non fisiologiche, nel plasma e nel sangue intero, dei livelli delle specie ridotte e ossidate dei principali tioli, nucleotidi piridinici e adenosinici (i cui intervalli di concentrazione sono stati preventivamente determinati nella popolazione sana e utilizzati come valori di riferimento), costituiscono una primaria risposta allo stress. Applicando un valore "arbitrario" a ogni parametro analizzato (N°=32) si ottiene un punteggio indicativo dell’entità dello stress ossidativo, uno score della graduazione del rischio. Con l’inserimento di altri parametri specifici delle prime fasi dello stress come gli enzimi Gpx, Gr, SOD o specifici di altri fattori di rischio è possibile costruire un algoritmo a scopo diagnostico utilizzabile come "check-up" nella popolazione sana e con fattori di rischio.
Gli antiossidanti, si possono classificare in tre gruppi: enzimi, proteine in grado di sequestrare i metalli e piccole molecole endogene ma per la maggior parte esogene, acquisibili con la dieta. Queste ultime, come le vitamine idro e lipo-solubili, sono considerate micro-nutrienti e provengono generalmente dal regno vegetale. Le piante sono inoltre fonti ricche di altre molecole a basso peso molecolare con attività fortemente antiossidante e classificate "non" nutrienti: i fitocomposti. Il ruolo dei fitocomposti non si limita comunque all’azione antiossidante, possono infatti limitare la proliferazione cellulare, indurre apoptosi, regolare l’attività degli enzimi delle Fasi I e II del metabolismo, modificare l’azione di estrogeni ed incrementare la risposta immunitaria.
Attualmente grande interesse rivestono i composti ricchi in flavonoidi, polifenoli e loro metaboliti per le capacità antiossidanti ed antibatteriche; per tali motivi ad un gruppo di forti fumatori e di pazienti con bronchiectasia è stato somministrato un estratto di radice di Pelargonium sidoides (Biotiker – Loaker Remedia) i cui principi attivi sono essenzialmente costituiti da cumarine, acido gallico, flavonoidi, flavanoli e fitosteroli. Questo fitocomposto è conosciuto per la sua azione antibatterica e le sue proprietà immunomodulanti soprattutto nelle affezioni a carico dell’apparato respiratorio. Scopo di questo lavoro è verificare "in vivo" l’eventuale azione antiossidante del Pelargonium sidoides valutando il grado di omeostasi, il substrato energetico ed il metabolismo riducente, prima e dopo la somministrazione di tale fitocomposto .
Materiali e metodi
Popolazione in studioPopolazione di controlloSono stati arruolati 120 soggetti volontari di età compresa tra i 20 e 70 anni, maschi e femmine, sani e senza fattori di rischio cardiovascolare come diabete, dislipidemia, iperomocisteinemia, ipertensione, fumo e obesità.Forti fumatori
Sono stati arruolati 10 forti fumatori (> di 20 sigarette/die, da oltre 20 anni) sani, cioè senza alcun segno clinico manifesto e con spirometria negativa di età compresa tra i 40 ed i 65 anni.Brochiectasiaci
Sono stati arruolati 9 pazienti, di età compresa tra i 35 e i 65 anni, portatori di bronchiectasia che spesso condizionano un’infezione cronica di patologie broncopolmonari singole o multiple, dove la maggiore quantità determina la maggiore gravità. Modalità di prelievo
Sono stati effettuati nel gruppo dei forti fumatori e dei brochiectasiaci prelievi ematici prima (prelievo basale=T0) e dopo (prelievo finale=T1) somministrazione di 30 gocce di Biotiker due volte al giorno per 60 gg.
Nella popolazione di controllo oltre al prelievo basale, un sottogruppo (N=10) è stato sottoposto a successivi prelievi mensili per testare l’eventuale variabilità biologica.Preparazione del campione
Vengono prelevati 6 mL di sangue intero in provetta vacutainer contenente EDTA. Quattro aliquote vengono diluite rispettivamente 1:2 con acqua distillata (per il dosaggio dei tioli totali); 1:2 con acido tricloroacetico al 10% p/v (TCA) (per il dosaggio dei tioli ridotti); 1:3 con acido perclorico al 7,2% v/v (PCA) (per il dosaggio dei nucleotidi adenosinici e pirimidinici ossidati); 1:2 con idrossido di potassio 0.5M (KOH) (per il dosaggio dei nucleotidi pirimidinici ridotti).Ognuna delle quattro aliquote viene immediatamente congelata in azoto liquido, dopo una rapida agitazione e conservata a –80°C fino al momento dell’analisi in HPLC. Il restante volume di sangue viene immediatamente centrifugato a 3000 g per 2 min. a 4°C allo scopo di separare il plasma.
Un’aliquota del plasma così ottenuto, viene diluita 1:2 con TCA (per il dosaggio dei tioli ridotti e della vitamina C), rapidamente agitato ed immediatamente congelato in azoto liquido, insieme alle restanti aliquote di plasma (per il dosaggio dei tioli totali e della vitamina E) e conservate a –80°C fino al momento dell’analisi in HPLC.
Vengono prelevati 3mL di sangue intero in provetta vacutainer da siero. Dopo centrifugazione a 3000 g per 10 min. a 4°C, il siero viene congelato a –80°C (per l’analisi dei lipoperossidi).
Un’aliquota di urina viene conservata a –80°C fino al momento dell’analisi in HPLC della neopterina/creatinina.
Analisi dei campioni
HPLC dei nucleotidi adenosinici e pirimidinici ossidatiATP, ADP, AMP, NAD+ e NADP+ vengono estratti ed analizzati come precedentemente descritto (10). In breve: il campione scongelato viene immediatamente centrifugato a 14000g per 10 min. a 4°C. Il surnatante acido viene portato a pH 6.5 con tampone borato 1 M a pH11 e iniettato (40 ?L) in un sistema HPLC (Varian con rivelatore UV a 254 nm) utilizzando due colonne in serie a fase inversa C-18, rispettivamente Chromolith performance 100x4.6mm Merck e Discovery 5um, 250x4.6mm Supelco-Sigma, eluite con gradiente discontinuo di metanolo in tampone fosfato 0.1M a pH 6 (9min a 0% di metanolo, nei successivi 6min fino al 2,5% di metanolo, nei successivi 2,5 min. fino al 9% di metanolo, nei successivi 2 min. fino al 10% di metanolo) ad un flusso di 1 mL/min.).
HPLC dei nucleotidi e pirimidinici ridottiNADH e NADPH vengono estratti ed analizzati come precedentemente descritto (10).
In breve: il campione scongelato viene diluito 1:3 con acqua distillata fredda ed agitato per 2 min ed ultrafiltrato su membrane da 50 kDa (Amicon- Millipore) mediante centrifugazione a 14000g per 40 min. a 4°C. L’ultrafiltrato viene neutralizzato con il 10% di volume di tampone fosfato 1M pH 6.5 e iniettato (50 ?L) in un sistema HPLC (Varian con rivelatore UV a 340 nm) utilizzando due colonne in serie a fase inversa C-18, rispettivamente Chromolith performance 100x4.6mm Merck e Discovery 5um, 250x4.6mm Supelco-Sigma eluite con gradiente discontinuo da 0 a 10% di metanolo in tampone fosfato 0.1M a pH 6 (5min a 0% di metanolo, nei successivi 6min fino al 2,5% di metanolo, nei successivi 2,5 min. fino al 6% di metanolo, nei successivi 5 min. fino al 10% di metanolo) ad un flusso di 1 mL .
HPLC dei tioli totali (cisteina, cisteinilglicina, omocisteina e glutatione)
Si scongelano le provette contenenti il sangue diluito 1:2 con acqua distillata ed il plasma. A 100 ?L di ciascun campione si aggiungono 10 ?L di tributilfosfina al 10% v/v in dimetilformamide. Dopo 30 min. a 4°C si aggiungono 100 ?L di TCA, si agita e si centrifuga per 2 min a 3000g; 100 ?L di surnatante vengono neutralizzati aggiungendo 100 ?L di tampone borato 1M a pH 11 contenente EDTA 4 mM e 10 ?L di idrossido di sodio 1.55 M. Ad ogni provetta si aggiungono 10 ?L di SBD-F. (7-Fluorobenzofurazan-4-solfonato di ammonio) alla concentrazione di 10 mg/mL di tampone borato 1 M a pH 9.5. Dopo 60 min a 60°C e al riparo dalla luce, gli addotti fluorescenti vengono iniettati (10 ?L) in un sistema HPLC isocratico (Varian con rivelatore fluorimetrico eccitazione: 385 nm; emissione 515 nm) utilizzando una colonna a fase inversa C-18 Discovery 5um, 250x4.6mm Supelco-Sigma eluita con tampone fosfato 0.1 M a pH 2.1 al flusso di 1 mL/min.
HPLC dei tioli ridotti (cisteina, cisteinilglicina, omocisteina e glutatione)
Si scongelano le provette contenenti il sangue e il plasma diluiti 1:2 con TCA. Si agita e si centrifuga per 2 min. a 3000g; 100 ?L di surnatante vengono neutralizzati aggiungendo 100 ?L di tampone borato 1M a pH 11 contenente EDTA 4 mM e 10 ?L di idrossido di sodio 1.55 M. Ad ogni provetta si aggiungono 10 ?L di SBD-F. Dopo 60 min a 60°C e al riparo dalla luce, gli addotti fluorescenti vengono iniettati (10 ?L) in un sistema HPLC isocratico come per i tioli totali.
HPLC della vitamina C
La vitamina C viene estratta e analizzata secondo il metodo di Hultqvist (11) modificato: si scongela la provetta contenente il plasma diluito 1:2 con TCA. Si agita e si centrifuga per 2 min. a 3000g. In un sistema HPLC isocratico (ESA con rivelatore elettrochimico al potenziale di 0.25 Volts) utilizzando una colonna a fase inversa C-18 Discovery 5um, 250x4.6mm Supelco-Sigma eluita con tampone fosfato 50 mM a pH 3.2 contenente 0.1 mM di EDTA e il 2% (v/v) di metanolo, al flusso di 1 mL/min., si iniettano 25 ?L di surnatante diluito 1:100 con la fase mobile.
HPLC della vitamina E
La vitamina E viene estratta e analizzata secondo il metodo di Teissier (12) modificato: 100 ?L di plasma vengono trattati con 400 ?L di metanolo, Si agita e si centrifuga per 2 min a 6000g. Cinquanta ?L del surnatante si iniettano in un sistema HPLC isocratico (Varian con rivelatore UV a 290 nm) utilizzando una colonna a fase inversa C-18 Discovery 5um, 250x4.6mm Supelco-Sigma eluita con metanolo al flusso di 1.5 mL/min.
HPLC della neopterina/creatinina
Si scongela l’urina e si centrifuga un’aliquota a 13.000g per 5 min. Si diluisce il surnatante 1:3 con tampone fosfato 15 mM a pH 3 (utilizzato anche come fase mobile) prima di iniettare 10 ?L nel sistema HPLC isocratico (Varian, corredato di due rivelatori in serie: un rivelatore UV per la lettura della creatinina impostato alla lunghezza d’onda di 235 nm, e un rivelatore fluorimetrico per la lettura della neopterina impostato ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 335 nm e di emissione di 450 nm). La colonna a fase inversa C-18 Discovery 5um, 250x4.6mm Supelco-Sigma utilizzata per l’analisi viene mantenuta ad una temperatura di 50°C e al flusso di 0.9 mL/min.
I cromatogrammi vengono automaticamente integrati e le concentrazioni degli analiti vengono calcolate nelle rispettive curve di calibrazione generate con concentrazioni crescenti di standard.
Determinazione colorimetrica dei lipoperossidi
I lipoperossidi circolanti nel sangue vengono misurati con un metodo spettrofotometrico usando un kit commerciale (dROMs test, Diacron, Grosseto, Italy). Il test sfrutta la capacità dei lipoperossidi a generare, in presenza di metalli di transizione, radicali liberi che reagendo con un cromogeno aumentano l’assorbanza della soluzione a 505nm. La concentrazione dei lipoperossidi è direttamente proporzionale alla concentrazione del complesso colorato.
Analisi statistica
Le differenze tra le medie degli score e dei parametri biochimici prima e dopo somministrazione di Biotiker, sono state calcolate con metodi non parametrici.
La significatività statistica è stata assunta a p< 0,05.
|